尊龙凯时(中国区)人生就是搏的细胞培养指南旨在为科研人员提供清晰的细胞培养步骤和注意事项，确保细胞培养的成功率和细胞活性。

一、细胞培养条件

细胞名称：贴壁生长细胞
生长特性：依赖于贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液

培养体系

本实验使用的基础培养基为MCDB105和M199的1:1混合物，最终浓度分别为15g/L和22g/L的碳酸氢钠，同时添加优质胎牛血清15%和双抗1%进行培养。

传代方法

建议在细胞生长至80%汇合度时进行第一次1:2传代。每隔2天更换培养基，以确保细胞状态最佳。如对比培养效果不理想，建议使用尊龙凯时(中国区)人生就是搏提供的完全培养基。

二、细胞收到后处理

收到细胞后，应至良好状态后加满完全培养液并封好瓶口，以确保细胞运输过程中的稳定性。使用75%酒精清洁细胞瓶外部，随后在超净工作台内进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5%CO2培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态，随后进行观察，并拍照记录不同倍数的细胞生长情况（推荐40x、100x、200x各一张）。前三天的照片为重要的售后依据，如不提供照片则视为细胞状态良好。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

1. 收集培养瓶中的培养液至离心管，保留5ml完全培养基并放入37℃、5%CO2培养箱培养。
2. 若细胞密度超过80%，可进行传代操作，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，并用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱消化1-2分钟，观察细胞脱落情况，若细胞大部分脱落，迅速加入5ml完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞以完全脱落后，吸出并转移至离心管，1000RPM离心5分钟。弃去上清，重悬于1-2ml完全培养基中。
4. 按1:2比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶面积达到80%时，弃去培养液，使用PBS清洗细胞一次。
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后置入冻存管中。
4. 将冻存细胞放入-80℃冰箱，若后期需转入液氮罐，需在-80℃环境下保存至少24小时后再转移。

四、细胞复苏

取出液氮中的细胞冻存管（佩戴防护装备），快速置于37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，随后用75%酒精擦拭管外。将细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清，以5ml完全培养基重悬后接种至T25培养瓶，放入37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。第二天更换新鲜培养基以确保细胞健康。

五、售后条款

尊龙凯时(中国区)人生就是搏注重客户反馈与细胞品质，以下情况可要求重发细胞：

1. 运输中出现各类问题，如细胞丢失、瓶身破损等。
2. 细胞污染，请在收到后48小时内提供真实实验结果。
3. 常温发货细胞静置超过24小时后大部分细胞未存活，需提供清晰照片。
4. 细胞活性出现问题，需在7天内提供相关实验结果。

对于因客户造成的细胞污染、错误操作等情况，我司不予以重发。详细情况应具体分析，通过沟通协商处理，感谢您对尊龙凯时(中国区)人生就是搏的信任与支持。