尊龙凯时(中国区)人生就是搏，细胞凋亡检测是生物医疗研究中的一项关键技术，广泛应用于疾病机制研究及药物筛选等领域。本文将详细介绍如何使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测。

实验原理

在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会从胞质转移至胞外，暴露于细胞外环境中，导致细胞膜的通透性增加，从而使得PS特异性的Annexin-V探针可以对其进行标记。Annexin-V为Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，具有很强的结合力，而PI则是一种经济且稳定的核酸染料，无法穿过正常细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但能够透过晚期凋亡及坏死细胞的膜，使细胞核呈现红色。在联合使用AnnexinV与PI时，活细胞和早期凋亡细胞不会被PI染色，而晚期凋亡和坏死细胞则会被FITC和PI双重标记，显示出双阳性结果。

实验材料准备

• AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒
• 细胞样本（悬浮细胞或贴壁细胞）
• 离心机
• PBS
• 荧光显微镜或流式细胞仪

实验方法

1. 细胞收集

悬浮细胞：在1000g的条件下离心5分钟，去除上清液。加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，再次进行1000g离心5分钟，去除上清，保留细胞沉淀。

贴壁细胞：小心吸取细胞培养液并保存。使用PBS洗涤后，加入适量的无EDTA胰酶消化液以消化细胞。随后，加入前面保存的培养液，轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，进行离心和重悬。

2. 重悬细胞

加入195μL Binding Buffer，轻轻重悬细胞至合适浓度。

3. 添加染料

① 加入5μL AnnexinV-FITC，轻轻混合，用于早期凋亡细胞的检测。

② 加入10μL PI Stain，轻轻混合，用于晚期凋亡或坏死细胞的检测。

4. 孵育

在室温下避光孵育10-20分钟，以确保染料与细胞充分结合。

检测与分析

流式细胞仪检测

1. 设置适当的通道检测AnnexinV-FITC和PI的荧光信号。

2. 设置三个对照组以校正背景信号及确定凋亡细胞比例：未染色组（检测自然荧光）、PI单染组（确定PI阳性阈值）、AnnexinV-FITC单染组（确定AnnexinV阳性阈值）。

荧光显微镜检测

1. 离心后用少量Binding Buffer重悬细胞并制备涂片。

2. 在荧光显微镜下观察，通常AnnexinV-FITC发出绿色荧光，PI则发出红色荧光。

3. 可通过拍照或计数对凋亡细胞的比例进行定量分析。

注意事项

1. 操作过程中尽量保持低温，以降低细胞代谢和染色时的自发荧光。

2. 避免长时间暴露于光线下，特别是FITC类染料，以免光照造成荧光淬灭。

3. 根据实验需求调整细胞数量和染料浓度。

4. 使用流式细胞仪时，请确保仪器已校准且通道设置正确。

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